1.     Основное направление исследований

Получение и характеристика трансгенных клеточных культур и линий животных для изучения процессов нейрогенеза. Создание систем направленного редактирования митохондриального генома млекопитающих. 

Задачи, решаемые в рамках основного направления на данном этапе:

1. Создание трансгенных линий эмбриональных стволовых клеток мыши, в геном которых строго специфично интегрированы репортерные гены флуоресцентных белков, маркирующие экспрессию нейральных генов. Получение химерных животных с маркированной экспрессией нейральных генов инъекционным методом.
2. Разработка и сборка генетических конструкций для специфичной модификации митохондриального генома. Разработка методов доставки генетических конструкций и/или их продуктов в митохондрии. Оценка эффективности доставки генетических конструкций в митохондрии. Характеристика эффективности разработанной системы.

2.     Аннотация базового бюджетного проекта подразделения

Сектор клеточных технологий был создан в январе 2014 г. Основное направление исследований является новым и пока не вошло ни в один бюджетный проект в связи с тем, что эти проекты формировались в конце 2013 года, когда сектор еще не существовал.

3.     Прикладные разработки

В секторе ведется разработка систем направленного редактирования митохондриального генома млекопитающих. Данные системы после их разработки, апробации на модельных животных и прохождении доклинических испытаний, могут быть использованы для генной и клеточной терапии митохондриальных заболеваний. Трудности применения разрабатываемых систем для генной и клеточной терапии связаны с отсутствием законодательной базы в области клеточных технологий в РФ.

4.     Иллюстрированное описание лучших результатов, полученных подразделением за последние 5 лет

Получены трансгенные линии ЭС клеток, в которых экспрессию гена бета-тубулина III (нейрального маркера) можно детектировать по флуоресценции репортерного гена EGFP.

Ген бета-тубулина III (Tubb3), был выбран в качестве маркера нейральной дифференцировки. На первом этапе работы была получена и охарактеризована линия эмбриональных стволовых (ЭС) клеток мыши. Эти клетки имели диплоидное модальное число хромосом и при инъекции в бластоцисту давали вклад во все три зародышевых листка и в зародышевый путь. Для маркирования экспрессии гена Tubb3 при помощи метода направленной модификации генома TALEN (Transcription activator-like effector nuclease) в 3`UTR этого гена вместо стоп-кодона была введена кассета P2A-EGFP-PGK-Puro-PA. Таким образом, экспрессию бета-тубулина III можно детектировать по флуоресценции репортерного гена EGFP. После трансфекции ЭС клеток и селекции на пуромицине были получены 18 трансгенных линий клеток. Молекулярный анализ показал встройку трансгена в целевом месте Tubb3 в четырех линиях ЭС клеток. Проверку функциональности трансгена проводили с помощью дифференцировки ЭС клеток в нейральные клетки с использованием стандартного протокола. На 13 день дифференцировки в телах и отростках клеток детектировали экспрессию EGFP. Дифференцировку в нейроны также подтвердили иммуноцитохимическим окрашиванием на специфический компонент промежуточных микрофиламентов нейронов – NF200 (рис. 1). Таким образом, были получены линии трансгенных ЭС клеток, содержащие кассету P2A-EGFP-PGK-Puro-PA в 3`UTR гена Tubb3, что позволяет использовать их для изучения процессов нейральной дифференцировки и трансдифференцировки.

Рисунок 1. Иммунофлуоресцентное окрашивание нейральных клеток полученных в результате дифференцировки трансгенной линии ЭС клеток мыши.

Разработан дизайн генетической конструкции, кодирующей нуклеазу для внесения направленного специфического одно/двуцепочечного разрыва в геноме митохондрий.

Болезни, обусловленные нарушениями в структуре митохондриальной ДНК (мтДНК), представлены широким спектром заболеваний, распределенных по различным нозологическим группам. Общая численность описанных на сегодняшний день в научной литературе болезней митохондриальной этиологии приближается к 400. В настоящее время отсутствуют эффективные способы направленной модификации митохондриального генома в связи с чем данное направление является актуальным и перспективным. Для того чтобы создать систему направленной модификации митохондриального генома на первом этапе была разработана структура генетической конструкции необходимой для внесения разрыва в мтДНК. Карта конструкции представлена на рисунке 2. Данная конструкция содержит ген нуклеазы Cas9 с нуклеотидной последовательностью адаптированной для экспрессии в клетках человека. В 5`-области гена Cas9 располагается «сильный» промотор – CMV и энхансер для активации экспрессии. Также в этой области находятся последовательности митохондриальной локализации (MTS) и 3хFLAG, которые необходимы для доставки Cas9 нуклеазы в митохондрии и её иммунофлуоресцентной детекции, соответственно. В 3`-области Cas9 располагается ген флуоресцентного белка TurboGFP и после него последовательность из 3`-нетранслируемой области гена SOD2, которая необходима для локализации мРНК, образующейся в процессе транскрипции с данной конструкции, рядом с внешней мембраной митохондрий. Такая локализация будет способствовать более эффективному проникновению нуклеазы Cas9 внутрь митохондрий. Помимо этого, разработанная генетическая конструкция содержит вспомогательные элементы для её наработки в бактериях. Разработка данной конструкции позволяет приступить к созданию и характеристике системы для направленной модификации мтДНК.

Рисунок 2. Схема генетической конструкции для направленной модификации митохондриального генома.

5.     Задачи, планируемые на перспективу: 

• Получение трансгенных линий мышей с маркированной экспрессией гена tubb3 для изучения процессов нейрогенеза и трансдифференцировки.
• Разработка методов доставки генетических конструкций и/или их продуктов в митохондрии и оценка эффективности этих методов.
• Характеристика системы направленной модификации митохондриального генома и оценка её эффективности для супрессии мутаций.

Совместители

Публикации

2016	Импорт нуклеазы Cas9 в митохондрии К.Е. Орищенко, Ю.К. Софронова, Е.Г. Чупахин, Е.А. Лунeв, И.О. Мазунин Гены и клетки, 2016, №2, Том XI, 100-105
	Five-year disease-free survival among stage II-IV breast cancer patients receiving FAC and AC chemotherapy in phase II clinical trials of Panagen Proskurina AS, Gvozdeva TS, Potter EA, Dolgova EV, Orishchenko KE, Nikolin VP, Popova NA, Sidorov SV, Chernykh ER, Ostanin AA, Leplina OY, Dvornichenko VV, Ponomarenko DM, Soldatova GS, Varaksin NA, Ryabicheva TG, Uchakin PN, Rogachev VA, Shurdov MA, Bogachev SS. BMC CANCER, 2016, 16:651. doi: 10.1186/s12885-016-2711-5
	Detection of Mutations in Mitochondrial DNA by Droplet Digital PCR J. K. Sofronova, Y. Y. Ilinsky, K. E. Orishchenko, E. G. Chupakhin, E. A. Lunev, I. O. Mazunin BIOCHEMISTRY-MOSCOW+, 2016, Vol. 81, No. 10, pp. 1031-1037.
	Characterization of avian paramyxovirus type 6 isolated from a Eurasian teal in the intersection of migratory flyways in Russia Sobolev I.A., Sharshov K., Yurchenko K., Korneev D., Glushchenko A., Alikina T., Kabilov M., Bi Y., Liu W., Gubanova N., Shestopalov A. ARCH VIROL, 2016, 161(11), pp. 3275-9
	Complete genome sequences of two Newcastle disease virus strains isolated from a wild duck and a pigeon in Russia Kabilov M.R., Alikina T.Y., Yurchenko K.S., Glushenko A.V., Gunbin K.V., Shestopalov A.M., Gubanova N.V. Genome Announcements, 2016, 4(6):e01348-16
2015	Онколитические свойства вируса болезни Ньюкасла Юрченко К.С., Губанова Н.В., Шестопалова Л.В., Шестопалов А.М. Тихоокеанский медицинский журнал, 2015, №3. С.: 14-18.
	Возможности бор-нейтронозахватной терапии в лечении злокачественных опухолей головного мозга Каныгин В.В., Кичигин А.И., Губанова Н.В., Таскаев С.Ю. Вестник Рентгенологии и Радиологии, 2015, №6. С.: 36-42.
	Activity of Heat Shock Genes’ Promoters in Thermally Contrasting Animal Species Lyubov N. Astakhova, Olga G. Zatsepina, Sergei Yu. Funikov, Elena S. Zelentsova, Natalia G. Schostak, Konstantin E. Orishchenko, Michael B. Evgen’ev, David G. Garbuz PLoS One, 2015, V.10, p. e0115536
	Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells VS Fishman, TA Shnayder, KE Orishchenko, M Bader, N Alenina and OL Serov CELL CYCLE, 2015, 14:8, 1188-1196
	Results of multicenter double-blind placebocontrolled phase II clinical trial of Panagen preparation to evaluate its leukostimulatory activity and formation of the adaptive immune response in patients with stage II-IV breast cancer Anastasia S Proskurina, Tatiana S Gvozdeva, Ekaterina A Alyamkina, Evgenia V Dolgova, Konstantin E Orishchenko, Valeriy P Nikolin, Nelly A Popova, Sergey V Sidorov, Elena R Chernykh, Alexandr A Ostanin, Olga Y Leplina, Victoria V Dvornichenko, Dmitriy M Ponomarenko, Galina S Soldatova, Nikolay A Varaksin, Tatiana G Ryabicheva, Stanislav N Zagrebelniy, Vladimir A Rogachev, Sergey S Bogachev and Mikhail A Shurdov BMC CANCER, 2015, 15:122 DOI 10.1186/s12885-015-1142-z
2014	The study of oncolytic properties of Newcastle disease virus strains isolated from birds Yurchenko K. S., Glushchenko A. V., Romaschenko A. V., Shestopalova L. V., Shestopalov A. M., Gubanova N. V. HUM GENE THER, 2014, Vol. 25, Iss. 12, P.: 9-10
	Изучение онколитических свойств природных изолятов вируса болезни Ньюкасла Юрченко К.С., Глущенко А.В., Губанова Н.В., Ромащенко А.В. Сибирский онкологический журнал, 2014, № S1. С. 133-134.
2011	Характеристика временных параметров проявления эффекта токсического действия инъекций экзогенной ДНК на фоне предобработки цитостатиком циклофосфаном Долгова Е.В., Проскурина А.С., Николин В.П., Попова Н.А., Алямкина Е.А., Орищенко К.Е., Шилов А.Г., Ефремов Я.Р., Черных Е.Р., Останин А.А., Богачев С.С., Прокопенко А.В., Малкова Е.М., Таранов О.С., Гвоздева Т.С., Рогачев В.А., Загребельный С.Н., Шурдов М.А. Вавиловский журнал генетики и селекции, 2011, Т. 15, № 4, С. 674-689
	Оценка безопасности, переносимости и гемостимулирующей активности препарата «Панаген» у здоровых добровольцев Дворниченко В.В., Пономаренко Д.М., Шевчук А.В., Юкальчук Д.Ю., Климова И.Д., Богачев С.С., Орищенко К.Е., Рогачев В.А., Шурдов М.А. Сибирский медицинский журнал, 2011, №6, том 105, С. 280-282
2010	Репарация межцепочечных сшивок молекулы ДНК Е.В. Долгова, А.С. Лихачева, К.Е. Орищенко, Е.А. Алямкина, С.С. Богачев, М.А. Шурдов Информационный вестник ВОГИС, 2010, № 2, Т. 14, стр. 332-356
	Роль замены G(-43)A в промоторном районе гена Xist при неслучайной инактивации Х-хромосомы у межвидовых гибридов обыкновенных полевок Орищенко К.Е. , Елисафенко Е.А., Закиян С.М. RUSS J GENET+, 2010, т.46, № 10, с. 1397-1400.
	Effect of double-stranded DNA on maturation of dendritic cells in vitro Alyamkina EA, Leplina OY, Sakhno LV, Chernykh ER, Ostanin AA, Efremov YR, Shilov AG, Proskurina AS, Orishchenko KE, Dolgova EV, Rogachev VA, Nikolin VP, Popova NA, Zagrebelniy SN, Bogachev SS, Shurdov MA CELL IMMUNOL, 2010, 266: 46-51
	Exogenous allogenic fragmented double-stranded DNA is internalized into human dendritic cells and enhances their allostimulatory activity Alyamkina EA, Dolgova EV, Likhacheva AS, Rogachev VA, Sebeleva TE, Nikolin VP, Popova NA, Kiseleva EV, Orishchenko KE, Sakhno LV, Gel'fgat EL, Ostanin AA, Chernykh ER, Zagrebelniy SN, Bogachev SS, Shurdov MA CELL IMMUNOL, 2010, 262: 120-126
	A strategy of tumor treatment in mice with doxorubicin-cyclophosphamide combination based on dendritic cell activation by human double-stranded DNA preparation Alyamkina EA, Nikolin VP, Popova NA, Dolgova EV, Proskurina AS, Orishchenko KE, Efremov YR, Chernykh ER, Ostanin AA, Sidorov SV, Ponomarenko DM, Zagrebelniy SN, Bogachev SS, Shurdov MA Genetic Vaccines and Therapy, 2010, 8(1): 7
2009	Молекулярно-генетическая характеристика регуляторного района гена xist полевки microtus rossiaemeridionalis К. Е. Орищенко, Е. А. Елисафенко, А. Э. Кель, С. М. Закиян RUSS J GENET+, 2009, 10, 45, 1341-1352
	Combined therapy with Cyclophosphamide and DNA preparation inhibits the tomor growth in mice Alyamkina EA, Dolgova EV, Likhacheva AS, Rogachev VA, Sebeleva TE, Nikolin VP, Popova NA, Orishchenko KE, Strunkin DN, Chernykh ER, Zagrebelniy SN, Bogachev SS, Shurdov MA. Genetic Vaccines and Therapy, 2009, V. 7, N 1

Конференции

2016	РЕЗУЛЬТАТЫ II ФАЗЫ КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПРЕПАРАТА «ПАНАГЕН» И ДАННЫЕ ПО 5-ЛЕТНЕЙ БЕЗРЕЦИДИВНОЙ ВЫЖИВАЕМОСТИ ПАЦИЕНТОВ, УЧАСТВОВАВШИХ В ИССЛЕДОВАНИИ С.С. Богачев, А.С. Проскурина, Т.С. Гвоздева, Е.А. Поттер, Е.В. Долгова, К.Е. Орищенко, В.П. Николин, Н.А. Попова, Е.Р. Черных, А.А. Останин, О.Ю. Леплина, Н.А. Вараксин, Т.Г. Рябичева, В.В. Дворниченко, Д.М. Пономаренко, С.В. Сидоров. XIII ВСЕРОССИЙСКАЯ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ С МЕЖДУНАРОДНЫМ УЧАСТИЕМ «ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ» памяти А.Ю. Барышникова
	СОЗДАНИЕ 3D ТКАНЕИНЖЕНЕРНОГО КОНСТРУКТА ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ КОСТИ В ТРАВМАТОЛОГИИ И ОРТОПЕДИИ Астахова Н.М., Корель А.В., Щелкунова Е.И., Николаев С.В., Орищенко К.Е., Кирилова И.А. Биомедицина-2016
	Study of osteogenic cells motility for tissue engineering protocols design. Astakhova N.M., Nikolaev S.V., Orishchenko K.E., Korel A.V., Zubairova U.S., Kirilova I.A. SBIOMED-2016
2014	Evaluation of micronucleation and viability of glioma cells in vitro neutron beams irradiated N. Gubanova, V. Kanygin, A. Kichigin, S. Taskaev 16th International Congress on Neutron Capture therapy
	Создание новой трансгенной линии мышей для изучения процессов нейрогенеза Орищенко* К.Е., Мензоров А.Г., Баттулин Н.Р., Кизилова Е.А., Пристяжнюк И.Е., Голубица А.Н., Железова А.И., Матвеева Н.М., Фишман В.С., Шевцова А.А., Рубцов Н.Б., Серов О.Л. VI Съезд ВОГИС
	Первичные культуры клеток как модель для исследования глиальных опухолей человека Ю. С. Макушева, Н. В. Рубцова, Н. В. Губанова, А. С. Гайтан, А. Л. Кривошапкин, В. А. Мордвинов I Международная конференция молодых ученых:биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов
2009	Определение и анализ регуляторных районов гена Xist у полевки Microtus rossiaemeridionalis Орищенко К.Е. Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2009", г. Москва
	Структурно-функциональная организация регуляторных районов гена Xist полевки Microtus Rosiaemeridionalis Орищенко К.Е., Елисафенко Е.А. Хромосома 2009, Новосибирск, 31 августа - 6 сентября

Гранты

2016	Комплексный анализ экспрессии генов в мозге ручных лисиц: исследование на уникальной селекционной модели доместикации РНФ, номер гранта 16-14-10216
2014	Исследование механизмов онколитического действия природных штаммов вируса болезни Ньюкасла. РФФИ, номер гранта 14-04-01196
	Компьютерно-экспериментальный анализ молекулярных механизмов регуляции экспрессии генов в клетках опухолей головного мозга РФФИ, номер гранта 14-04-01906 А
2011	Федеральная целевая программа «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы. Поисковые научно-исследовательские работы по теме: «Изучение молекулярных механизмов синергичного действия химиотерапевтического цитостатика циклофосфана и препарата экзогенной ДНК» Номер гранта Гос.контракт №14.740.11.0922
2010	Федеральная целевая программа «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы. Научно-исследовательские работы по теме: «Разработка технологии создания индивидуальных вакцин на базе инновационных подходов генерации дендритных клеток с использованием интерферона для лечения онкологических и инфекционных (вирусных) заболеваний человека» Номер гранта Гос.контракт №14.740.11.0007
2005	Анализ функционирования антисмысловых генов Xist/Tsix и их регуляторных элементов в центре инактивации Х-хромосомы у обыкновенных полевок Грант по программе «Молекулярная и клеточная биология»

Патенты

2011	Способ лечения онкологических заболеваний Алямкина Е.А., Долгова Е.В., Лихачева А.С., Рогачев В.А., Себелева Т.Е., Николин В.П., Попова Н.А., Орищенко К.Е., Стрункин Д.Н., Черных Е.Р., Загребельный С.Н., Богачев С.С., Шурдов М.А. Номер патента 2429019